近几年疫情突袭，防护用品需求暴增，phi-X174噬菌体作为对人体 指示物，代替病毒用来研究防护产品上的防病毒穿透能力。

　　但噬菌体滴度要求至少在108pfu/ml及以上，目前国内实验室能够大量制备噬菌体的扩增方法并完成此项试验的报道很少。

　　为了能顺利研究出噬菌体扩增的试验条件，中国科学院南京土壤研究所对噬菌体MS2和X174的双层琼脂平板和液体培养基扩增方法进行了建立，研究表明用高浓度感染扩增方法可获取一次大量的高浓度纯噬菌体溶液。

　　在此基础上，沙格实验室研究整理出制备大量高滴度噬菌体的条件。

　　大肠杆菌悬浮液制备

　　将冻干粉形式的大肠杆菌根据菌种说明书在生物安全柜内进行复苏培养一天后，从长满大肠杆菌的营养琼脂板上分别挑取一环加入50mL的噬菌体营养肉汤中，37℃下160~180rpm/min振荡培养2~3小时，用可见分光光度计在600nm处测OD值在0.1~0.4范围内，此时大肠杆菌的菌含量可达108cfu/ml。

　　即停止培养，传入生物安全柜内留作宿主大肠杆菌悬浮液。 

　　噬菌体复苏

　　从新鲜大肠杆菌培养液中吸取0.2ml放入营养琼脂平板上，用一次性无菌涂布棒均匀涂满整个平板。向冻干粉形式的噬菌体管内滴入0.5mL的营养肉汤，充分溶解后，用移液枪将溶解液以点涂的方式加入到涂布满大肠杆菌的营养琼脂平板上，将平板放入37℃培养箱培养24h。

　　之后用接种环轻轻刮掉平板的菌层，50mL宿主大肠杆菌悬浮液中，37℃下160~180rpm/min振荡培养16-18h或24h。经分离纯化，作为噬菌体母液。

　　质检噬菌体

　　制备两个营养琼脂平板，取1~2mL的大肠杆菌加入到营养琼脂平板上，用涂布棒涂匀后，用移液器将多余的菌液吸出（菌液过多会覆盖噬菌斑，过少则长不满平板，影响噬菌斑形成），等待晾干后，分别取噬菌体母液10µL以点滴的方式在平板上滴3-4个点。

　　干燥后，放入37℃培养箱倒置培养6-18h，观察平板上点滴的地方是否形成较大的空斑，如果形成空斑，则表明噬菌体母液复苏成功，如果无空斑，则表明噬菌体母液活性较小或可能失去活性，需重新鉴定冻干粉是否由于储存条件不当失活。

　　噬菌体扩增培养条件

　　制备两瓶200ml新鲜的含宿主大肠杆菌噬菌体营养肉汤编号为A、B，取噬菌体母液10mL加入到上述2瓶含宿主细菌的肉汤中，混合成含有大肠杆菌宿主和噬菌体的肉汤。

　　A瓶在37℃下(160 - 180)r/min振荡培养3-4天，B瓶在YY/T0689-2008的条件为37℃下（225±25）r/min剧烈振荡1h~5h，直到细菌裂解。

　　两者区别是延长培养时间让噬菌体充分侵染宿主大肠杆菌，释放大量的子噬菌体。

　　噬菌体分离纯化条件

　　将培养好的噬菌体营养肉汤等量装入离心管中进行分离纯化，其中A瓶按YY/T0689-2008规定的10000rpm/min离心20min的条件，B瓶用4000rpm/min离心10min的条件。

　　离心后，A瓶选择装有0.22µm滤膜的功率300W的抽滤装置进行分离纯化噬菌体。B瓶按带有0.22µm滤膜的30ml注射器进行过滤。

　　验证扩增后的噬菌体滴度

　　制备上层琼脂、下层琼脂、噬菌体营养肉汤稀释液，将两瓶纯化好的噬菌体原液分别逐级稀释至10-6、10-7、10-8。在空试管内分别加入0.2mL的宿主大肠杆菌（浓度至少108cfu/mL）。

　　再分别取A、B两瓶中的噬菌体稀释液0.1mL加入到宿主试管内，最后加入2.5mL的上层琼脂，混匀后，倒入下层琼脂板上，摇匀，凝固后，37℃倒置培养(至少)6-18h。观察结果A、B瓶滴度达1010pfu/ml、107pfu/ml。

　　结论

　　高离心参数可能会损失一部分噬菌体活性，达不到试验要求，选择低速离心参数，能更好的保护噬菌体活性不受损失，但其缺点是转速低，细胞碎片分离不太完全，可过滤两次去除更多细胞碎片。

　　但用注射器过滤时比较耗时耗力，可选择功率300W的抽滤装置，可更好的提高过滤效率。

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